原核生物利用CRISPR-Cas抵抗在細胞上形成圖中結構的病毒。 圖片來源：Tessa

　　它是個非常了不起的工具。我想知道這個系統(tǒng)從頭到尾如何工作。

　　Francisco Mojica并非第一個看見CRISPR的人，但他可能是第一個為它著迷的人。他還記得1992年當他首次瞥見可能引發(fā)一場生物技術革命的這個微生物免疫系統(tǒng)的那一天。他在評估地中海嗜鹽菌的基因測序數(shù)據(jù)，注意到14個不尋常的DNA序列，每個有30個堿基。它們的前后讀數(shù)大致相同，每次重復35個堿基左右。很快，他看到更多的類似現(xiàn)象。Mojica由此踏入該領域，使重復序列研究成為他在西班牙阿利坎特大學集中研究的對象。

　　這并不是一個受歡迎的決定。他的實驗室連續(xù)數(shù)年沒有收到資助。在會議上，Mojica會抓住機會逮住他能找到的任何大人物追問他們如何看待這種奇怪的小序列重復。“別太關注重復。”他們總是這樣警告他。“很多有機體中都有很多重復。我們知道它們已經(jīng)有幾年了，但并不知道它們中的大多數(shù)如何工作。”

　　今天，人們已經(jīng)了解到更多關于這個團簇的信息，即定期中間短回文的重復序列，這使它獲得了CRISPR的名字，并幫助CRISPR-Cas微生物免疫系統(tǒng)毀滅入侵細菌。但是盡管生物醫(yī)藥領域大多數(shù)人已經(jīng)開始敬畏這一系統(tǒng)的運行機制，尤其是一種叫作CRISPR-Cas9的版本，因為它可被用于編輯基因，Mojica和其他微生物學家仍對該系統(tǒng)的一些基礎問題以及它如何運行感到困惑。它如何演變？如何影響微生物演化？為什么一些微生物在使用它，而另一些則沒有？它是否在基礎生物學上擁有一些其他仍待了解的優(yōu)點？

　　它來自哪里？

　　諸如CRISPR-Cas的生物學優(yōu)勢非常明顯。原核生物（細菌以及鮮有人知道的被稱為古生菌的單細胞生物）面臨基因入侵者的不斷沖擊。病毒數(shù)量遠超過原核生物，其數(shù)量比可達10:1，并且每過兩天就會殺死世界上一半的細菌。原核生物還會交換DNA的廢棄物：質粒。它們可能是寄生的——通過使宿主的資源逐漸枯竭迫使其自殺，如果宿主在設法驅逐這個“搭便車”的分子。似乎沒有什么地方是安全的：從土壤到海洋到地球上最不宜居的荒涼地方，基因入侵者無處不在。

　　原核生物已經(jīng)進化出大量武器來應對這些威脅。但這些防御有些遲鈍。每個酶都經(jīng)過規(guī)劃以識別特定的序列，只有當一個微生物獲得爭取的基因復本，它才可能得到保護。CRISPR-Cas更具活力。它能以類似于人類抗體在感染后提供長期免疫的方式適應和記住具體的基因入侵者。“當我們一開始聽到這種假設，我們認為這種方式對于簡單的原核生物可能過于復雜了。”荷蘭瓦赫寧根大學微生物學家John van der Oost說。

　　Mojica和其他人在看到CRISPR回文重復之間的空間中的DNA有時和病毒基因組中的序列相匹配時，他們推斷了CRISPR-Cas的功能。從那時起，研究人員開始研制出與CRISPR相關聯(lián)的特定蛋白，并在細菌和古生菌接觸特定病毒或質粒之后，將這些間隔的序列添加到基因組中。來自于那些間隔區(qū)的RNA會指導其他Cas蛋白吞掉任何與該序列相匹配的入侵DNA或RNA。

　　它如何工作？

　　近年來，很多關于Cas蛋白補充間隔區(qū)的分子細節(jié)已經(jīng)得到詳細了解，但病毒DNA在化學上近似于宿主DNA。在一個承載著DNA的細胞中，這些蛋白如何知道將哪個DNA添加到CRISPR-Cas記憶中？

　　這一賭注非常高：如果一個細菌添加了它本身DNA的一個片段，它會因為自動免疫進攻而自殺。立陶宛維爾紐斯大學生化學家Virginijus Siksnys說，“這些酶是一把雙刃劍。”

　　可能是因為細菌和古生菌種群能夠吸收一定錯誤，美國北卡羅萊納大學微生物學家Rodolphe Barrangou說。如果其他細胞能夠在病毒攻擊之后蓬勃發(fā)展，一些細胞的自殺可能并不重要。

　　實際上，當病毒潛入細菌生態(tài)系統(tǒng)時，通常1000萬個細菌中會有一個細菌獲得一個自我防御的間隔區(qū)。這一幾率使得研究是什么驅動間隔區(qū)識別非常困難，同時了解為什么其他細胞失敗之后另一個細胞會繼續(xù)下去也很困難。“當它真正發(fā)生的時候，很難捕捉到那些細菌。”紐約洛克菲勒大學微生物學家Luciano Marraffini說。

　　它還可能做什么？

　　一些間隔區(qū)的起源是另一個謎題。到目前為止觀測到的低于3%的間隔區(qū)與DNA數(shù)據(jù)庫中任何已知的序列相匹配。

　　這反映了人們對病毒了解得多么少。大多數(shù)測序工作集中于那些感染者、牲畜或是莊稼。“我們對細菌的敵人知之甚少，特別是瘋狂的古生菌的敵人。”雅典佐治亞大學RNA生物學家Michael Terns說。

　　還有可能一些間隔區(qū)是已經(jīng)不存在或者變異到不可分辨的病毒的鬼魂。但第三種可能性也是熱門的研究領域。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了CRISPR-Cas系統(tǒng)不僅是阻止基因入群者的案例。在一些細菌中，CRISPR-Cas成分會控制DNA修復、基因表達和生物膜的形成。它們還能決定一個細菌影響其他細菌的能力：嗜肺軍團菌會導致退伍軍人病癥，它們一定擁有Cas蛋白Cas2，從而感染其天然宿主變形蟲。“一個主要的問題是有多少生物在防御之外。” 馬薩諸塞大學醫(yī)學院分子生物學家Erik Sontheimer說，“這是未來幾年若干只‘靴子’要落地的領域。”

　　為什么只有一些微生物會用它？

　　無論CRISPR-Cas有什么其他的功能，很明顯一些微生物使用它的幾率超過另一些。超過90%的古生菌具有基于CRIPSR的免疫，而經(jīng)過測序的細菌僅有1/3擁有它，Koonin說。并沒有非原核生物，甚至是單細胞生物，被發(fā)現(xiàn)存在CRISPR-Cas。

　　其中一種叫作納古菌的古生菌就像一種寄生蟲一樣，寄生在接近沸水中的另一種古生菌身上，并分發(fā)了很多與能量制作相關的基因和常規(guī)的細胞管家。然而，在其49萬DNA字母的說明書的小世界中，納古菌在CRIPSR-Cas系統(tǒng)上擁有約30個間隔區(qū)。“其一大部分基因組致力于CRISPR。”英國圣安德魯斯大學分子生物學家Malcolm White說，“CRISPR一定非常重要，然而我們并不知道其原因。”

　　這樣的不同表明有一些關鍵的生態(tài)因素支持CRISPR-Cas系統(tǒng)，更重視病毒防御或其他益處，而非細胞自殺的風險，埃克塞特大學彭林校園微生物學家Edze Westra說。極端環(huán)境似乎會支持CRISPR-Cas系統(tǒng)，但Westra強調，類似系統(tǒng)的頻率在更適宜居住的棲息地的細菌中間也會呈現(xiàn)出一定變化。例如鳥類病原體——雞毒支原體在其宿主從雞轉變?yōu)橐叭笗r會丟掉其CRISPR-Cas裝備。然而，為什么該系統(tǒng)在雞身上有用，但在野雀身上無用，誰也說不清楚，Westra說。

　　存在多少種CRISPR-Cas類型？

　　研究人員已經(jīng)正式分辨出6種不同的CRISPR系統(tǒng)，包含19個亞種。“實際上我們只知道它們中一小部分在發(fā)揮作用。”Marraffini說。

       解開那些機制可能就會找到利用CRISPR-Cas系統(tǒng)的新生物技術。例如，備受科學家喜愛的CRISPR—Cas9屬于II 系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用轉錄自間隔區(qū)序列的RNA分子導向一種酶，切斷入侵病毒或DNA質粒。

　　系統(tǒng)III是自然界最常見的CRISPR-Cas系統(tǒng)，也是了解最少的系統(tǒng)。到目前為止，證據(jù)表明它們不是對DNA或RNA自身作出回應，而是對把DNA轉譯到RNA內部的過程作出回應。其他的系統(tǒng)可能也會突然出現(xiàn)，尤其是研究人員將他們的尋找目標擴展到培養(yǎng)皿之外時，包括了來自環(huán)境DNA樣本的基因測序。

　　對于Mojica來說，探索這種多樣性并回答關于CRISPR系統(tǒng)的基本問題比它們引發(fā)的革命更吸引人。“我知道它是個非常了不起的工具。它妙極了。它可以被用于治療疾病。”Mojica說，“但這不是我的事。我想知道這個系統(tǒng)從頭到尾如何工作。”（晉楠編譯）

(責編：魏艷、趙竹青)